Factor Von Willebrand (VWF)

El factor Von Willebrand (VWF) es una glicoproteína de gran tamaño presente en el plasma humano, el monómero del VWF tiene un peso molecular de unos 250 kDa, la función más importante es mediar la adhesión de las plaquetas al endotelio vascular, además protege al factor VIII de la degradación proteolítica y localiza al factor VIII en el sitio de la lesión vascular. Está formado por dos monómeros unidos a través de puentes disulfuro formando dímeros quienes a su vez se combinan para formar multímeros con una vida media de 12 horas. Los multímeros tienen un peso molecular comprendido ente 500 y 20,000 kDa. La actividad hemostática de los multímeros es directamente proporcional a su tamaño.

El VWF se produce en las células endoteliales y en los megacariocitos (los precursores de las plaquetas) y se almacena en las plaquetas (gránulos α) hasta la activación de las plaquetas y su posterior liberación.

Los multímeros von Willebrand se pueden separar en 4 grupos:

  • Multímeros de peso molecular bajo (LMWM)
  • Multímeros de peso molecular intermedio (IMWM)
  • Multímeros de peso molecular alto (HMWM)
  • Multímeros de peso molecular ultra alto (UHMWM)

Después de la síntesis, aproximadamente el 95% de los multímeros endoteliales de VWF (LMWM, IMWM y HMWM) se secretan al plasma y el resto (multímeros ultra grandes- UHMWM) se almacenan en los gránulos α de los megacariocitos.

Clasificación de la enfermedad

 La enfermedad de von Willebrand es el tipo más común de trastorno hemorrágico. De acuerdo con la Federación mundial de Hemofilia (WFH) es el trastorno de la coagulación que afecta aproximadamente al 1% de la población mundial, debido a que a menudo los síntomas son leves, una considerable mayoría de pacientes permanece sin diagnosticar. No obstante, en todos los tipos de enfermedad los episodios hemorrágicos pueden ser graves y pueden requerir tratamiento, especialmente durante o después de cirugías o trabajos dentales.

Diferentes técnicas son utilizadas conjuntamente para caracterizar la enfermedad de von Willebrand, como la determinación del Antígeno VWF, actividad VWF (Rco), actividad del Factor VIII, el cociente actividad VWF / Ag VWF, la unión VWF: FVIII, análisis genéticos, etc (ver tabla 1). La electroforesis de los multímeros del VWF es una de estas técnicas y permite la detección y análisis de la distribución de los multímeros del VWF del plasma.

La causa de esta enfermedad es una anomalía cuantitativa (en los tipos 1 y 3) o cualitativa (en el tipo 2) del factor von Willebrand (von Willebrand factor – VWF). El tipo 2 está dividido en 4 subtipos (2A, 2B, 2M y 2N) en función del mecanismo molecular alterado que origina el VWF defectuoso. La pérdida o disminución de los HMWM (y a veces de los IMWM) es pues la responsable de síntomas hemorrágicos como los del subtipo 2A.

 

La clasificación de la enfermedad de von Willebrand es primordial en el plano clínico para la atención del paciente, ya que el tratamiento debe adaptarse al tipo o subtipo de la VWD, considerando que no existe cura, el tratamiento y el monitoreo regular de la enfermedad permiten prevenir o limitar el riesgo de sangrado.

 

Electroforesis en gel de agarosa.

El análisis de los multímeros del factor von Willebrand (vWF) es una herramienta de laboratorio importante para distinguir entre los numerosos subtipos de la enfermedad de von Willebrand (vWD), la comparación de resultados entre laboratorios puede ser difícil cuando el proceso se realiza de manera manual, por ello, Sebia ha desarrollado el kit que permite la estandarización en gel de Agarosa.

La separación electroforética de los multímeros se realiza después de tratar las muestras con un detergente aniónico (SDS) que, al unirse a las proteínas, oculta su carga intrínseca y las desnaturaliza, las diferencias de migración entre las proteínas tratadas con el detergente aniónico sólo dependen entonces de su peso molecular, posteriormente son inmunoprecipitados con un antisuero específico, las diferentes bandas son reveladas a continuación en el gel utilizando un anticuerpo marcado con peroxidasa y un sustrato específico.

Los geles listos para usar, sin necesidad de eliminar el exceso de buffer y la automatización en la aplicación y migración de la muestra permiten obtener una alta reproducibilidad con mínima manipulación por parte del operador permitiendo ofrecer resultados en el mismo día; desafortunadamente por el momento no hay un método estandarizado para la cuantificación de los multímeros.

 

El software del instrumento permite a través del escaneo del gel, superponer la curva control (en amarillo) sobre la del paciente (en azul) para el análisis de la distribución.

 

Comparación de resultados

En 2016 el Dr. E. J . Favaloro et al., en la Clínica de la Universidad Saint Luc, de Bruselas, Bélgica realizó la evaluación clínica de los multímeros Hydragel 5 von Willebrand de Sebia demostrando que el kit permite la discriminación de los diferentes subtipos de la enfermedad con respecto a la distribución de los diferentes multímeros de la proteína, además de tratarse de un método es simple, preciso y rápido.

En 2016 la Dra. Marika Pikta et al., realizó la evaluación de la respuesta biológica de la Desmopresiona usando el análisis de los multímeros del factor de von Willebrand demostrando que el método permite emitir resultados dentro del día, es sensible, proporciona información útil no solo para diferenciar tipos / subtipos de VWD, sino también para monitorear la respuesta a intervenciones terapéuticas como DDAVP.

Para 2017 el mismo grupo de trabajo presentó el artículo “Evaluación preclínica de un ensayo de electroforesis comercial semiautomático y rápido para multímeros del factor von Willebrand” donde concluyó que el ensayo multimérico comercial VWF (multímeros Hydragel 5 von Willebrand; Sebia, Lisses, Francia) puede representar una buena alternativa a los ensayos internos tradicionales. Es un método fácil de realizar y se puede implementar con éxito en cualquier laboratorio clínico. La visualización de la distribución multimérica y el análisis densitométrico, junto con la clasificación multimérica LMW, IMW y HMW aplicada, proporcionan una resolución adecuada para clasificar correctamente los casos de VWD de tipo 1, 2A, 2B y 3.

El estudio presentado en 2020 en el congreso virtual de ISTH lidereado por Hospital Italiano, Instituto Universitario y la academia de medicina de Buenos Aires, Argentina, sobre los resultados del perfil multimérico del factor von Willebrand (VWF) mediante una prueba electroforética comercial (Hydragel 5 von Willebrand Multimers) y clásica casera con una electroforesis discontinua en gel de agarosa al 1%, demostró que la prueba comercial es útil y apropiado para el cribado del perfil multimérico de VWF en los laboratorios clínicos.

 

Bibliografía.

  • Comparison of von Willebrand factor (VWF) multimeric profile obtained by a commercial electrophoretic test (Hydragel 5 von Willebrand Multimers) and classical home-made with a discontinuous 1% Agarose gel electrophoresis, M. López, Hospital Italiano, Instituto Universitario, academia de medicina de Buenos Aires, 2020
  • Preclinical evaluation of a semi-automated and rapid commercial electrophoresis assay for von Willebrand factor multimers, Marika Pikta, Galina Zemtsovskaja, Hector Bautista, Georges Nouadje, Clin Lab Anal. 2018
  • Timea Szanto4 | Margus Viigimaa2 | Valdas Banys5
  • Evaluation of a new commercial von Willebrand factor multimer assay, J . FAVALORO*† and S. OLIVER*, the official Journal of the World Federation of Hemophilia, 2017
  • Clinical evaluation of the Hydragel 5 von Willebrand Multimers of Sebia, A. Lemaitre, G. Nouadje, G. Beaulieu, H. Bautista, S. Desmet, C. Gavard, S. Eeckhoudt, Cliniques universitaires Saint Luc, Brussels, Belgium and Sebia, Evry, France, 2016
  • Assessment of biological response to desmopressin using von willebrand factor multimers análisis, Marika Pikta, Kadri Saks, Kristi Lepik, Galina Zemtsovskaja, Karin Villemson, Hector Bautista, Georges Nouadje, North Estonia Medical Centre.
  • Enfermedad de von willebrand: introducción para médicos de atención primaria, D. Lillicrap, P. James, world federation of hemophilia, 2009.